三七二醇皂昔對大腦中動脈梗塞大鼠行為學(xué)病理形態(tài)學(xué)及血清白細胞介素一6的影響

摘要:目的:探討三七三醇皂苷對大鼠腦梗死后不同恢復(fù)時點相關(guān)病理門理改變及對血_清白細胞介素-6(工L -6)水平的形響。力一法:采用線栓法制備大腦中動脈梗塞大鼠模型啊ACO)，研究三七三醇皂苷對大腦中動脈梗塞大鼠腦缺血_后不同時問點的行為障礙、缺血_組織病理形態(tài)及血_清白細胞介素-6水平的Y響。結(jié)果:阻}析大腦中動脈后3d內(nèi)，所有大鼠都出現(xiàn)程度不同的運動障礙，血_清工L-6水平顯著川高。三七三醇皂苷可減輕MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)，部分改善其活動度，明顯抑制其血_清中工L-6水平。結(jié)論:三七三醇皂苷能有效抑制級聯(lián)反應(yīng)中炎性細胞囚了幾-6的產(chǎn)門，減輕或消除腦缺血_級聯(lián)反應(yīng)中的炎鄉(xiāng)l補反應(yīng)，發(fā)揮保護神經(jīng)兀的作用。

關(guān)鍵詞:三七三醇皂苷 腦梗死 白細胞介素-6 大腦中動脈梗塞大鼠模型 實驗研究

Effect of PTS on praxiology, pathomorphology and serum IL一6 in rats with middlecerebral artery occlusion

ZOU Wei-meng, ZHA工.Jian wing, CU工Fang yuan, WANG Xi-ling, ZHU Ling-qun, ZOU Yi-huai(Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China)Abstract: Objectivee To investigate the effect of PTS on the related pathophysiological changes and serum ILr6 levelat different time points after the middle cerebral artery occlusione MCAOe in rat's brain. Methodse The model of focal cerebralischemia of rat was established by the suture-occluded method.The effect of PTS on the behavioral disturbance，the pathologicalchange of ischemia tissue and the level of serum IL-6 at different time points(3d,7d,28d) after MCAO and cerebral ischemia inrats were studied. Resultse After MCAO,different degrees of motion disturbances were observed in all rats. The infarct spot canbe observed in all groups except the normal. The nerve cell necrosis can be found in all rats after 24 hour of MCAO. The resultshowed that PTS could improve the degree of motion disturbance ,reduce the infarct spot obviously; after MCAO, the serumILr6 were increased obviously but could be reduced by PTS. Conclusione PTS can protect the neurons，reduce and eliminate theinflammatory reaction of cerebral ischemia cascade reaction effectively, which may relate to its inhibiting effect on cell factorssuch as ILr6 production after cerebral ischemia

Key WOrdS: PTS; Cerebral ischemia; IL-6; MCAO; Experimental study

中藥三七活血化淤而不傷正氣，用十腦梗死的臨床治療取得了較好療效。木研究通過觀察三一L提取物三一L三醇皂昔(P T S)在不同時一間點對大腦中動脈梗塞大鼠模型(m fiddle cerebral artery occhtsion,M CAO)的行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)和抑制炎性介質(zhì)方ICI的影響，探討PTS促進腦梗死后功能恢復(fù)的機制，為治療腦梗死后不同時一點的作用提供新的實驗依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物健康雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量0300士20} g,清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有卜良公司，許可證號:SCX K(京)2002-00030

2.藥物與試劑三七通舒膠囊:成都華神集團股份有限公司制藥)一生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字220030109;產(chǎn)nuu批號:061002 X H 021;規(guī)格:何粒200m g，含PTS 100m g)。尼莫地平片:天津市中火藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(Ir}藥準(zhǔn)字H 200439150;產(chǎn)uu扎匕號:060608;規(guī)格:何)'; 30m g)。R at IL-6 E L ISA試劑盒:美國加利弗尼業(yè)州R ap i}l B io L ab產(chǎn)u (C a七N o.3R 035，產(chǎn)uu扎匕號:10090522)，購自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有n}公司。

3.儀器與設(shè)備SPO T-II數(shù)碼成像系統(tǒng)((d iagn-ostic instsum tints公司);石蠟切片機(德國L eicaR M 2135);光學(xué)顯微鏡(日木OLYMPUS BX60型);128C型C tin ih io全自動酶標(biāo)儀;L D 5-2A型離心機(北京醫(yī)用離心機)一)。

4.方法將大鼠稱質(zhì)量后隨機分為正常組和手術(shù)組。手術(shù)組采用改良的L ongaT法制備M CAO模型。動物清醒后采用LongaI`分標(biāo)準(zhǔn)}o分:無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:對側(cè)前爪不能充分伸展;2分:向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時一向?qū)?cè)傾斜;4分:不能行走，息識喪失)進行神經(jīng)功能評分，1-3分者一納入實驗，0分、4分者一剔除。將納入的手術(shù)動物隨機分為3組:模型組、PTS組和尼莫地平組。后兩組動物自手術(shù)日開始，分別子三七通舒混懸液和尼莫地平混懸液灌胃。給藥劑量按大鼠與人體表ICI積等效劑量折算，前者瓜4ui g 100擴子川I當(dāng)十成人用量loom g 60kg 1 d-1)的10子R，后者(L.73m g 100g 1 cT1)}I I當(dāng)十成人用量(120m g 60kg 1 d 1)的BTR}正常組和模型組動物自手術(shù)日開始給子去離子水灌胃。各組均何天給藥1次，何3天稱體質(zhì)量1次以幣新}I-算給藥量，十術(shù)后3d, 7d和28d三個時一間點分別取材。觀察各組大鼠術(shù)后5h, 1d, 2d, 3d時一的L onga七}`分和術(shù)后當(dāng)日、3d, 7d, 28d時一的活動度變化。術(shù)后3d, 7d, 28d分別取各組大鼠7只，麻醉后腹卞動脈采血，3 000響in離心10m in汾離血清，-200C凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法((E L工SA)測定血清幾-6;用恒流泵依次灌注生理鹽水200m 1, 4%多聚甲醛200m咽定腦組織，切片脫水浸蠟包埋，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

5.統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0 fouwindows統(tǒng)計分析軟件，所有實驗數(shù)據(jù)以z士、表不，組間均數(shù)的比較經(jīng)方差齊性檢驗后以單因素方差分析統(tǒng)不}一結(jié)果。

結(jié)果

1.行為學(xué)觀察

1.1神經(jīng)功能評分見表1。大鼠M CAO術(shù)后多十1-3h內(nèi)清醒。術(shù)后5h神經(jīng)功能缺損癥狀較幣，L onga評分較高，術(shù)后48h缺損神經(jīng)功能有所恢復(fù)，L onga評分呈下降趨勢，術(shù)后72h PTS組和尼莫地平組L onga}`分顯著低十模型組，差異有顯著統(tǒng)不l一學(xué)b,義中<0.01) o

1.2一般狀態(tài)正常組大鼠精神好，反應(yīng)靈活，活動度大。其余各組術(shù)后3d精神均較差，反應(yīng)遲鈍，扎堆蜷縮;術(shù)后7d模型組精神、反應(yīng)及活動度仍較差，PTS組和尼莫地平組的狀態(tài)有一定好轉(zhuǎn)，活動度較大，無扎堆蜷縮;術(shù)后28d，各組大鼠的一般狀態(tài)均接近正常，活動度無明顯差異。

2. HE染色光鏡檢測結(jié)果正常組的皮層細胞形態(tài)正常，核仁清楚，神經(jīng)細胞數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整。術(shù)后3d時一，模型組皮層組織梗死中心區(qū)神經(jīng)兒、膠質(zhì)細胞和血管大量壞死，可見少量皺縮神經(jīng)少:和小膠質(zhì)細胞、細胞骨架消失或嚴(yán)幣破壞，組織結(jié)構(gòu)疏松呈篩網(wǎng)狀，軟化灶明顯，梗死灶周邊區(qū)部分神經(jīng)少:腫脹，胞漿伊紅著色變淺，形態(tài)變圓，體積增大，分布不均，另一部分神經(jīng)兒濃縮，核周質(zhì)濃縮著色較深，被空泡的神經(jīng)纖維圍繞，神經(jīng)兒形態(tài)變?yōu)槎嘟切位蛏刃?，血管可見粒細胞附壁及浸?PTS組與尼莫地平組的梗死范圍明顯小十模型組，梗死邊緣組織結(jié)構(gòu)未完全破壞，殘存神經(jīng)兒較多，周圍散在膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)兒、膠質(zhì)細胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應(yīng)明顯輕十模型組。術(shù)后7d時一，模型組較術(shù)后3d時一的表現(xiàn)有好轉(zhuǎn)趨勢，膠質(zhì)細胞增生，細胞數(shù)目有所增多。術(shù)后28d時一，模型組膠質(zhì)細胞明顯增生，細胞數(shù)目增多。PTS組與尼莫地平組術(shù)后7d, 28d時，病理形態(tài)改變顯著輕十同期模型組。

3.血清II. - 6水平見表2。模型組血清IL-6水平隨著病程的延長呈下降趨勢，術(shù)后28d與該組術(shù)后3d比較顯著降低(p<0.05),但在3個時一間點均高十正常組(P<0.01) o PTS組和尼莫地平組IL.-6的水平隨時一間的變化趨勢與模型組相似，術(shù)后7d和28d與自身術(shù)后3d比較顯著降低，有統(tǒng)不l一學(xué)息義。日‘PTS組和尼莫地

討論

木實驗通過研究腦梗死大鼠功能損傷、恢復(fù)動態(tài)過程中的腦保護機制和促康復(fù)因素等，為PTS用十腦梗死的臨床治療提供了一定實驗依據(jù)。

1.行為學(xué)變化

1.1神經(jīng)功能評分術(shù)后3d, PTS組和尼莫地平組L onga評分顯著低十同組術(shù)后5h盼藥前)評分，較同期模型組下降速度快，說明兩組均能改善腦梗死后大鼠神經(jīng)功能;術(shù)后7d各組大鼠神經(jīng)功能基木恢復(fù)，接近正常水下。以上實驗結(jié)果說明，腦梗死后早期應(yīng)用PTS對神經(jīng)功能恢復(fù)有一定幫助，但其恢復(fù)機制具體為何，是否為促進了神經(jīng)的再生，尚需進一步探討。

1.2活動度的觀察術(shù)后3d，各組手術(shù)大鼠活動度均較差，扎堆蜷縮;術(shù)后7d, PTS和尼莫地平組大鼠活潑性有明顯改善，模型組狀態(tài)較差;術(shù)后28d,各組整體狀態(tài)均接近正常大鼠，無明顯差異，提不藥物干預(yù)可以加快M CAO大鼠整體狀態(tài)的恢復(fù)。

2.病理形態(tài)學(xué)變化木研究所采用的HE染色能初步觀察腦組織神經(jīng)兒的病理改變。觀察結(jié)果表明，PTS組與尼莫地平組對大鼠缺血的腦組織均有明顯的促恢復(fù)作用，中西藥治療組與對應(yīng)時一間模型組比較，神經(jīng)兒缺血性損害程度明顯減輕，卞要表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)兒缺血性損害程度減輕，恢復(fù)速度加快。

3.血清IL.-6水平大鼠試驗以及臨床研究均已發(fā)現(xiàn)在腦缺血級聯(lián)反應(yīng)中，有多種細胞因子參與，局部的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腦缺血缺氧時一腦細胞的損傷和壞死，同時一全身血液循環(huán)中炎癥因子也出現(xiàn)相應(yīng)的變化Ci-s l o是具有多項功能的細胞因子，卞要由T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，在腦組織中產(chǎn)生IL.-6的細胞是星形細胞和小膠質(zhì)細胞0研究已證實在腦缺氧缺血模型中IL.-6具有神經(jīng)保護作用[n, s7但工L-6產(chǎn)生過多又可加幣腦細胞損傷。研究表明，缺氧缺血性腦損傷時一，顱內(nèi)IL-6水平迅速增高、活性增強，導(dǎo)致腦細胞的水腫和壞死[[6-i]。陳雨振

研究證實IL-6水平同腦梗死體積和神經(jīng)功能受損程度成正相關(guān)口，是腦損傷恢復(fù)期腦梗死體積的獨立預(yù)測指標(biāo)。木實驗中模型組血清工L-6水平隨著病程的延長呈下降趨勢，術(shù)后28d與自身術(shù)后3d比較顯著降低(p<0.05)，在3個時一間點均高十正常組(P < 0.01)。PTS組和尼莫地平組工L-6的水平隨時一間的變化趨勢與模型組相似，術(shù)后7d和28d與自身術(shù)后3d比較顯著降低，日‘PTS組和尼莫地平組在各時一間點均顯著低十同期模型組。升高的IL-6能刺激細胞間%k}l I }}}分子ICAM-1的合成，減少其抗體的表達，使炎性細胞大量聚集在病變區(qū)域，增加中性粒細胞在化學(xué)趨化因子的刺激下，釋放氧自由基，與其他炎性細胞因子協(xié)同發(fā)揮細胞毒性作用[[8 ]而PTS和尼莫地平可以降低血清IL.-6水平，這可能是其抑制腦缺血級聯(lián)反應(yīng)中炎癥過程、減輕腦缺血損傷的機制，為恢復(fù)奠定良好的基礎(chǔ)。

綜上所述，木實驗研究認為，PTS對急性腦梗死具有較好的治療效果，表現(xiàn)為:改善神經(jīng)功能缺損癥狀;減輕缺血區(qū)神經(jīng)兒損害程度;抑制腦缺血級聯(lián)反應(yīng)中炎癥介質(zhì)的表達等，為臨床應(yīng)用PTS治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實驗依據(jù)。近年來，關(guān)十中藥提取物治療中風(fēng)的研究蓬勃興起，已在臨床及多種大鼠模型上印證了中藥的療效，治療中風(fēng)的作用機制度也日見清晰。有研究表明PTS可以縮小腦缺血再灌注大鼠的梗死ICI積，抑制細胞凋亡[[8-9]。因此，PTS的作用機制可能為多水平、多通道、多靶點的綜合效應(yīng)，其對腦缺血損傷的神經(jīng)保護、再生和幣塑作用的實現(xiàn)途徑尚待進一步研究證實。